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Introduction

生物反應器是用于微生物和細胞的體外培養，并通過生化反應或發酵過程獲取產物的裝置，是生物合成、生物發酵、生物制藥領域中關鍵的設備之一。而平行生物反應器可同一系統控制多個單元，使其保持各項參數的高度一致性，是合成生物學產業化關鍵技術工藝設計方案重要的環節，其核心功能是高通量篩選（high-throughput screening）和工藝放大。

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Application

Background

藻藍素（Phycocyanobilin，PCB）天然存在于藍藻光感應系統中，在光能的吸收和傳遞中起著至關重要的作用，在光遺傳學的研究中被廣泛應用。由于其具有亮麗的天藍色，可以作為天然色素在食品飲料中呈色，安全健康，營養豐富，是FDA唯一批準的藍色食品添加劑。PCB還具有抗氧化、消除自由基、修復細胞延緩衰老、保水抗凍的作用，廣泛應用于化妝品領域。此外，作為一種安全的藥物，口服PCB在體內可以轉化為NADPH氧化酶的有效抑制劑，在治療阿爾茨海默癥方面表現出巨大潛力；PCB對冠狀病毒主要蛋白酶的活性也具有潛在的抑制作用，有潛力應用于防治近年來爆發的新型冠狀肺炎病毒。目前，PCB的獲取方法主要采用高溫甲醇分解法從螺旋藻中提取。該方法存在諸多問題：（1） 甲醇高溫熱解需要耗費大量的能量，造成能源浪費；（2） 螺旋藻中與PCB共存的其他色素，如葉綠素、葉黃素等一系列前體，對后期產物純化有不利影響；（3）螺旋藻生長周期較長，限制了藻藍素的生產效率和應用。因此，從天然藻類中提取高純度的PCB是一項復雜且不經濟的方法，而采用合成生物學的方法合成PCB具有降低成本、節約能源和提高純度的優點，目前已有研究人員在5 L發酵罐實現了PCB世界最高水平合成。

Strategy

首先，通過比較選擇了來源于T. elongatus的HO1和來源于Synechocystis sp的PcyA來合成PCB，在此基礎上，確定了含有強誘導啟動子(T7lac)的高拷貝數質粒(pRSFDuet-1)最適合表達這兩種酶(圖1，圖2)。

▲圖1 用于PCB合成的模塊。灰色區域包括參與ALA替代途徑（C4或C5途徑）的酶合成；紅色區域包括參與血紅素合成的酶和中間體；藍色區域包括參與PCB合成的酶和輔酶因子。

Figure 1. Modules for PCB synthesis. The gray block includes the enzymes involved in the alternative pathways (C4 or C5 pathway) for ALA synthesis; the red block includes enzymes and intermediates involved in heme synthesis; the blue block includes enzymes and cofactors involved in PCB synthesis.

▲圖2優化HO和PcyA的表達策略以合成藻藍素。（a）從不同來源選擇HO和PcyA；（b）HO1和PcyA表達的質粒和啟動子的優化。藍色和深灰色條表示PCB和分別為OD600。

Figure 2. Optimize the expression strategy of HO and PcyA to synthesize phycocyanin. (a) Selection of HO and PcyA from different sources; (b) optimization of plasmids and promoters for HO1 and PcyA expression. The blue and dark-gray bars represent the concentrations of PCB and OD600, respectively.

此外，在中等拷貝數的pCDFDuet-1載體中，采用DNA支架以2:1的比例實現HO1和PcyA的有效組裝(圖3)。

▲圖3通過DNA支架調節HO和PcyA比例促進藻藍素合成

Figure 3. Regulation of HO and PcyA ratio by the DNA scaffold to improve PCB synthesis.

隨后，通過直接補充血紅素前體ALA和適度過表達血紅素生物合成途徑中的關鍵酶(HemB和HemH)，增加細胞內前體物質供應，促進PCB合成。由于催化血紅素合成PCB的兩步酶促反應都伴隨著鐵氧還蛋白（Fd）和Fd-NADP+還原酶（Fnr）的循環再生，研究人員通過表達nadK基因（編碼NAD+激酶）來加速輔因子循環，進一步增強了PCB合成（圖4）。

▲圖4 PCB合成中的輔因子增強循環

Figure 4. Enhanced cycle of cofactors for PCB synthesis.

此外，研究人員還通過添加還原劑作為輔助，發現當培養基中加入維生素C或谷胱甘肽時，藻藍素產量會得到提高，進一步優化了維生素C的添加量，發現添加5 g/L維生素C時，最適合PCB生產。

最后，分別在搖瓶和發酵罐水平對發酵條件進行優化（圖5）。

▲圖5在5L發酵罐中放大分批和補料分批發酵。（a）分批發酵；（b）600g補料分批發酵/L葡萄糖和8g/L MgSO4·7H₂O；（c）通過添加600 g/L葡萄糖、8 g/L MgSO₄·7H₂O和200 mg/L FeSO₄·7H₂O進行補料分批發酵；（d）通過添加600 g/L葡萄糖、8 g/L MgSO₄·7H₂O、200 mg/L FeSO₄·7H₂O和5 g/L(NH₄)₂SO₄進行補料分批發酵

Figure 5. Scale-up batch and fed-batch fermentation in a 5 L fermenter. (a) Batch fermentation; (b) fed-batch fermentation by feeding with 600 g/L glucose and 8 g/L MgSO₄·7H₂O; (c) fed-batch fermentation by feeding with 600 g/L glucose, 8 g/L MgSO₄·7H₂O, and 200 mg/L of FeSO₄·7H₂O; (d) fed-batch fermentation by feeding with 600 g/L glucose, 8 g/L MgSO₄·7H₂O, 200 mg/L of FeSO₄·7H₂O, and 5 g/L (NH₄)₂SO₄

在搖瓶水平，在30℃條件下用0.8 mM IPTG誘導，采用含有200mg/L ALA、20 mg/L FeSO4·7H?O和5 g/L維生素C的MR培養基有利于提高PCB的產量。在發酵罐水平，采用pH-stat法進行補料分批發酵，添加600g/L葡萄糖、8g/L MgSO4·7H?O和200 mg/L FeSO4·7H?O，在發酵罐水平獲得藻藍素28.32 mg/L，是至今報道的最高產量。此研究為在大腸桿菌中合成藻藍素或血紅素衍生物及其他天然色素提供了策略。

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Conclusion

提取耗能大、純化復雜且原料獲取周期長的藻藍素通過生物合成的方法實現了目前發酵最高的產量，以大腸桿菌為工程菌成功構建PCB完整代謝通路，通過基因調控手段（過表達關鍵酶及相關酶上游基因等）和輔料添加來促進PCB的合成，再于生物反應器內對菌種進行放大培養并對培養條件進行優化，采取補料分批發酵的方法在5 L發酵罐水平獲得了PCB的高產量合成。

合成生物學是從原料到菌種再到產品的全鏈條設計和優化，可以在改造和優化天然表達體系的同時，將動物源和植物源的代謝路徑構建到微生物體系中，重新合成全新的人工生物體系，最終實現目標代謝物的異源表達，將原料以較高的速率最大限度地轉化為產物。而平行生物反應器是合成生物學產業化關鍵技術工藝設計方案重要的環節，其核心功能是高通量篩選和工藝放大，研究目標菌種在較大培養體系下的生長行為，優化生長pH、補料速度、攪拌速度、誘導劑添加、通氣量等培養條件，實時監測體系內溶氧、溫度等生長參數，多個反應器同時控制，使發酵過程一致，發酵結果具有一致性與平行性。“新芝·主元”MPB平行生物反應器，針對不同培養需求設計開發了500 mL、1000 mL和2400 mL三款不同容積的發酵設備，單元模塊數量可按需拓展，適用于菌種的發酵工藝優化、工藝固定的菌種高通量篩選、最適培養基篩選等方向，涉及基因工程、生物制藥、酶工程、合成測序、代謝途徑/ 網路及生物底盤的設計與改造等多個領域。平行生物反應器上下游行業廣泛，是研究合成生物學的得力助手，如有興趣，期待您的咨詢。

圖源：DOI: 10.1021/acssynbio.2c00016