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▲NGS高通量測序基本流程
Basicprocess for high-throughput sequencing NGS
對長鏈DNA(通常指生物染色體DNA)片段化的主要原因是短鏈DNA片段有利于進行DNA分子快速雜交和高靈敏目標檢測,可顯著提升測序效率。目前,常用的染色體脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid, DNA)分子片段化方法主要有四種,分別為:DNA限制性酶切法、水動力剪切法、超聲波斷裂法、噴射霧化法,四種方法各有利弊。
▲DNA分子結構形態
Molecularstructure and morphology of DNA
超聲打斷基于水動力剪切法和超聲波斷裂法,是最常見的DNA片段化方式。其原理為:液體在高頻率的脈沖作用下,產生無數的高壓點和低壓點,伴隨產生的空化泡存在幾毫秒又因壓力變化而爆破,在這個過程中液體內形成瞬時高強度剪切力,這種作用力可以破碎細胞、影響蛋白質和剪切DNA。在此特別推薦新芝生物的一款特色產品:SCIENTZ18-A超聲波DNA打斷儀,采用非接觸式的工作方式,單次最高處理量可達12個樣品,是染色質免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)和DNA剪切研究平臺的標準化工具。
超聲波DNA打斷儀是將DNA暴露于均勻的超聲體系中進行無偏剪切,從而產生的大量均勻大小的雙鏈DNA,具有以下優勢:
樣品零污染:非接觸式封閉破碎,降低污染風險
處理效率高:單次可處理12個樣品,處理速度快
無差別打斷:DNA片段集中無偏好
等溫處理:配備冷水機,恒溫打斷防止ChIP實驗中蛋白質變性
使用高速分散器(例如XHF-DY)或研磨器(例如SCIENTZ-12或DY89-II)將生物樣品于冰浴條件(例如XB-70)下進行處理以獲得均質溶液;
對獲得的均質溶液,一般使用超聲細胞破碎機(例如為SCIENTZ-IID)或高壓細胞破碎機(例如JG-IA)進行處理,特殊樣品可配置冰浴環境,以獲得含有細胞內容物的溶液;
對細胞破碎后的溶液進行冷凍離心(例如HSC-2015L),取上清液備用;
4.1將破碎后溶液放置于0.2 mL或0.5 mL EP管,于適配器中旋緊螺母進行固定;
4.2將適配器置于水浴環境中,開啟配套冷水機,設置溫度為6℃;
4.3待溫度降至設定溫度時,設定DNA打斷參數(如超聲開20 s,超聲關25 s,功率300 W,超聲總時間30 min),啟動打斷程序;
4.4完成打斷后,取下DNA樣品低溫保存防止降解,用于進一步研究。
▲大腸桿菌DNA打斷效果
▲DNA濃度為50ng/uL的打斷效果
SCIENTZ18-A超聲波DNA打斷儀采用恒溫、非接觸的方式對樣品進行打斷、勻漿和混合,具有無菌操作、無損作業、微量打斷的特點,同時處理多個樣品可完美適配二代測序,適用于多類生物樣品,是ChIP和DNA剪切研究平臺的重要工具。
新芝生物專業研發生產超聲波細胞粉碎機、超聲波清洗機和超聲波細胞破碎儀等各種科研實驗儀器與工業化生產設備
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